Les protéines antigel hélicoïdales polyproline de type II sont répandues dans les collemboles et sont probablement apparues il y a plus de 400 millions d'années à l'époque ordovicienne

Oct 06, 2023

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 8880 (2023) Citer cet article

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Les protéines antigel (AFP) se lient aux cristaux de glace pour empêcher les organismes de geler. Une diversité de plis AFP a été trouvée chez les poissons et les insectes, y compris les hélices alpha, les protéines globulaires et plusieurs solénoïdes bêta différents. Mais la variété des AFP chez les arthropodes incapables de voler, comme les collemboles, n'a pas encore été correctement évaluée. Ici, l'activité antigel s'est avérée présente chez 18 des 22 espèces de collemboles des zones froides ou tempérées. Plusieurs méthodes ont été utilisées pour caractériser ces AFP, notamment l'isolement par purification par affinité sur glace, la spectrométrie de masse MALDI, l'analyse de la composition en acides aminés, le séquençage par spectrométrie de masse en tandem, le séquençage du transcriptome et les enquêtes bioinformatiques sur les bases de données de séquences. Tous ces AFP avaient une teneur élevée en glycine et devaient avoir le même pli hélicoïdal de polyproline de type II, un pli unique aux collemboles. Ces hexapodes sont apparus au cours de la période ordovicienne, les deux ordres connus pour produire des AFP ayant divergé il y a environ 400 millions d'années pendant la période glaciaire andine-saharienne. Par conséquent, il est probable que l'AFP est apparue alors et a persisté dans de nombreuses lignées au cours des deux périodes glaciaires suivantes et des périodes chaudes intermédiaires, contrairement aux AFP de poissons qui sont apparus indépendamment pendant la période glaciaire cénozoïque commençant il y a environ 30 millions d'années.

Les organismes vivant dans des environnements sous zéro doivent s'adapter pour éviter les lésions cellulaires dues au gel. La formation de cristaux de glace dans les tissus vivants présente des risques de déshydratation cellulaire et de rupture des membranes cellulaires, entraînant la mort1. Les organismes occupant des niches qui connaissent des températures inférieures à zéro produisent souvent des protéines antigel (AFP), qui fonctionnent en adhérant aux cristaux de glace et en empêchant leur croissance2. Une fois lié, la croissance de la glace est limitée aux zones autour de l'AFP, provoquant la formation de micro-courbures sur la surface de la glace3,4. Cela rend énergétiquement défavorable pour l'eau de rejoindre le réseau de glace, ce qui entraîne une dépression de la température de congélation en dessous de la température de fusion, qui est appelée hystérésis thermique (TH) et est utilisée pour quantifier la puissance d'un AFP.

La première PAG caractérisée provenait d'un poisson téléostéen5. Depuis, des PAG ont été observées chez d'autres poissons6, insectes7,8 et micro-organismes9,10,11. Chez les poissons, on pense que les PAG sont apparues au cours de l'ère cénozoïque, il y a 20 à 40 millions d'années, lorsque la glace de mer aux pôles était présente pour la première fois depuis environ 200 millions d'années12,13. Dans l'eau de mer, la forte concentration de NaCl (~ 0,45 M) abaisse la température de congélation de l'eau de mer à ~ - 1,9 ° C. Comme le sang de poisson a une concentration de soluté plus faible et gèle à ~ − 0,8 °C, tout contact avec des cristaux de glace pourrait nucléer la congélation et tuer le poisson5. Par conséquent, les PAG de poisson doivent être produits en quantités adéquates et avec une activité suffisante pour diminuer la température de congélation du corps d'au moins 1,1 °C. Cela donne un avantage sélectif à ces poissons, car ils peuvent chasser en toute sécurité pour se nourrir dans les mers chargées de glace où les poissons dépourvus de PAG risquent de geler. Quatre types d'AFP ont été trouvés dans les poissons : (1) AFP de type I riche en alanine, (2) AFP de type II de type lectine, (3) AFP de type III dérivée de l'acide sialique synthase et (4) glycoprotéines antigel (AFGP). Avec des plis différents qui remplissent tous la même fonction, cela soulève la question de savoir comment ces AFP sont apparus pour la première fois14.

Les AFP de type I alpha-hélicoïdales riches en alanine ont évolué indépendamment à au moins quatre reprises15. Les AFGP répétitives simples sont apparues à deux reprises indépendantes dont une fois à partir d'un gène trypsinogène par duplication et divergence16. Les AFP de type II ont évolué à partir d'un ancêtre de lectine de type C et se sont propagées à au moins deux branches taxonomiques distantes de poissons par transfert latéral de gènes17,18. La duplication et la divergence d'un gène de l'acide sialique synthase ont donné naissance à la famille de gènes AFP de type III, qui n'a été trouvée que dans une branche de poissons19. On pense que ces plis AFP de poissons sont apparus au cours des dernières dizaines de millions d'années en réponse à la glaciation polaire20. Dans d'autres branches d'organismes comme les insectes21,22 et les micro-organismes23,24, il existe également des exemples où différents plis AFP sont apparus indépendamment pour effectuer la même tâche.

Les collemboles sont les arthropodes terrestres les plus abondants et se trouvent sur tous les continents25. Ces petits organismes (la plupart ne mesurent généralement que quelques millimètres de long) vivent généralement dans le sol, mais certaines espèces vivent dans les arbres, sur les étangs ou les surfaces humides entourant les pierres, ou sur les glaciers. Les collemboles tirent leur nom d'un organe abdominal, le collophore, qui est impliqué dans la régulation osmo- et ionique26. Une deuxième caractéristique anatomique abdominale déterminante est un organe à ressort connu sous le nom de furca, qui leur permet d'échapper aux prédateurs en "sautant". Cela leur a valu leur surnom de « collemboles ». Ces organismes primitifs sont apparus il y a environ 450 millions d'années et on recense près de 10 000 espèces répertoriées à ce jour27. Ceux qui vivent dans des environnements sous zéro ont des mécanismes de tolérance au froid pour survivre dans ces conditions difficiles, dont l'un est la production d'AFP. Auparavant, quelques espèces de collemboles avaient une activité TH28,29,30,31, une résistance au froid et des capacités de surfusion32, mais aucune étude systématique des types d'AFP présents et de leur distribution dans les collemboles n'a été réalisée à ce jour.

Le premier collembolan AFP caractérisé était la petite isoforme de 6,5 kDa de Hypogastrura harveyi (HhAFP)29. Il a été prédit que HhAFP avait un pli hélicoïdal de polyproline de type II (PPII) riche en glycine33, une structure qui a ensuite été confirmée par cristallographie aux rayons X34,35. Ce pli, qui semble unique aux collemboles, est constitué de deux couches d'hélices PPII antiparallèles reliées par des régions en boucle. Chaque rotation autour de l'hélice a une longueur d'exactement trois résidus avec des répétitions tripeptidiques de G-X1-X2, où X1 est souvent de la glycine. Le noyau de la protéine contient les résidus de glycine tournés vers l'intérieur, permettant un emballage serré en raison de l'absence de chaînes latérales33. Le compactage des hélices permet à un réseau de liaisons hydrogène de se développer entre les squelettes des hélices, ce qui augmente la stabilité du pli36. Les deux couches ont toutes deux une face pointue vers l'extérieur. Une surface est plate, contient de petits résidus hydrophobes et on pense qu'elle fonctionne comme la surface de liaison à la glace (IBS)37. Cette surface est riche en alanine, mais contient également des résidus sérine, thréonine et valine. La surface opposée est inégale et contient des résidus plus gros, dont certains sont polaires ou chargés. H. harveyi produit également une isoforme AFP plus grande de 15,6 kDa qui est proposée pour avoir 13 hélices de polyproline38.

Un homologue putatif de HhAFP a été récemment caractérisé à partir de Megaphorura arctica (MaAFP) collecté en Islande31. Bien que le MaAFP de 6,5 kDa partage de grandes similitudes dans la séquence codante avec le HhAFP, leurs régions non traduites (UTR) sont divergentes au point que l'ascendance commune n'a pas pu être définitivement établie. De plus, les isoformes d'AFP de 9,6 kDa de Granisotoma rainieri (GrAFP) ont été étudiées39. La structure de GrAFP a été modélisée comme étant un faisceau de polyproline de type II avec neuf hélices, ce qui a été confirmé par cristallographie aux rayons X. Lorsque les UTR des cinq ADNc de GrAFP ont été comparés, les plus dissemblables ne partageaient que 69 % d'identité de séquence. Par conséquent, un manque de similitude entre les UTR de différentes espèces ne réfute pas l'homologie.

Ici, nous avons caractérisé les AFP de 18 espèces de collemboles de nombreuses familles au sein de deux des quatre ordres existants de collemboles, collectés sur quatre continents différents. L'étendue de l'analyse a été déterminée par la quantité de biomasse disponible. De petites quantités de collemboles (< 100 mg de tissu lyophilisé) ont été utilisées pour déterminer l'activité TH et la formation de la glace. Les AFP ont été purifiées à partir d'échantillons plus grands (> 100 mg de tissu lyophilisé) par purification par affinité sur glace (IAP) et caractérisées par MALDI-MS, composition en acides aminés et/ou spectrométrie de masse en tandem. Des transcriptomes ont été générés à partir de certaines espèces pour déduire des séquences AFP au niveau de l'acide nucléique et, dans certains cas, pour exprimer de manière recombinante les protéines codées. Les AFP présentes dans les différents collemboles testés ici ont toutes inhibé la croissance de la glace sur le plan basal, suggérant qu'elles pourraient être hyperactives. Lorsqu'une analyse plus détaillée était possible, tous les AFP examinés avaient le même motif de répétition de tripeptide riche en glycine indicatif du faisceau hélicoïdal PPII. À ce jour, ce pli n'a été trouvé que chez les collemboles et sa présence dans des espèces éloignées suggère que le pli du faisceau hélicoïdal PPII est originaire d'une espèce de collembole basal, peu de temps après l'apparition du groupe.

Ici, 20 nouvelles espèces représentant cinq familles ont été testées pour TH (tableau supplémentaire 1). La plupart des espèces ont été collectées sur le terrain par les auteurs, tandis que quelques-unes ont été fournies à partir de cultures d'autres laboratoires. Les collemboles étaient généralement conservés pendant plusieurs années dans des boîtes de Pétri avec du plâtre humide de Paris mélangé à du charbon de bois, et nourris de levure de boulanger séchée et/ou d'algues vertes ad libitum. Toutes les espèces ont été maintenues à 20 °C avec 12 h de lumière et 12 h d'obscurité. Les exceptions à cette procédure étaient M. arctica et Entomobrya nivalis, qui ont été collectés sur le terrain et acclimatés au froid en laboratoire (tableau supplémentaire 1), et Cryptopygus antarcticus qui ont été congelés immédiatement après avoir été collectés sur le terrain. H. harveyi29 et G. rainieri39, qui ont complété le groupe d'étude de 22 espèces, ont été collectées comme décrit précédemment.

Pour induire la synthèse d'AFP, les spécimens ont été acclimatés dans l'obscurité et au froid à 10 °C pendant 19 jours, puis à 5 °C pendant 13 jours et à 1,5 °C pendant 28 jours. Les animaux ont ensuite été lyophilisés pendant 2 jours. Les animaux séchés ont été ajoutés 1: 8 (rapport poids / volume) au tampon (Tris – HCl 50 mM (pH 7, 8), NaCl 150 mM, phénylthiocarbamide 1 mM et 1 × cocktail d'inhibiteurs de protéase Roche sans EDTA) et homogénéisés à la main à l'aide d'un pilon en plastique jetable dans un tube de microcentrifugeuse de 1, 5 ml. Toutes les manipulations et le stockage temporaire des échantillons ont été effectués sur de la glace ou à 4 ° C pour éviter la dénaturation thermique de l'AFP. Les homogénats ont été centrifugés à 16 300 xg pendant 30 min à 4°C. La fraction aqueuse sous la couche lipidique a été retirée pour les mesures de TH.

Les extractions d'AFP pour la caractérisation des protéines ont été réalisées en utilisant > 100 mg d'animaux lyophilisés. Les échantillons de tissus ont été homogénéisés dans un tampon (Tris – HCl 50 mM (pH 7, 8), NaCl 150 mM, phénylthiocarbamide 1 mM et cocktail d'inhibiteurs de protéase Roche sans EDTA 1 ×) à l'aide d'un disperseur IKA ULTRA-TURRAX (Staufen, Allemagne). L'homogénat a été centrifugé à 22 000 xg pendant 30 minutes et le surnageant a été filtré à travers de la laine de verre pour éliminer les lipides. Les AFP dans le surnageant filtré ont été récupérés à l'aide de quatre cycles de purification sur coquille de glace, comme décrit précédemment40. La fraction de glace finale pour chaque préparation a été concentrée à < 500 µL à l'aide d'un filtre AmiconUltracel 3 K (MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) centrifugé dans une centrifugeuse Sorvall ST16R à 3000 × g.

Les compositions d'acides aminés ont été déterminées au SickKids Proteomics, Analytics, Robotics & Chemical Biology Center (SPARC, The Hospital for Sick Children, Toronto, ON, Canada) par hydrolyse acide comme décrit précédemment40 et ont également été utilisées pour calculer la concentration en protéines.

MALDI-TOF MS a été réalisée au Protein Function Discovery Facility (Université Queen's, Kingston, ON, Canada) en utilisant une matrice d'acide alpha-cyano-4-hydroxycinnamique sur des gouttelettes séchées avec un SCIEX Voyager DE Pro en mode linéaire. Le séquençage des protéines par spectrométrie de masse en tandem a été effectué au SickKids Proteomics, Analytics, Robotics & Chemical Biology Center (SPARC, The Hospital for Sick Children, Toronto, ON, Canada).

Des échantillons d'ARN ont été extraits de 30 à 50 mg de tissu stocké dans RNAlater (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA). L'extraction a été effectuée comme décrit précédemment39. Le transcriptome de C. antarcticus a été assemblé au Sequencing & Genotyping Center (University of Delaware, Newark, DE, USA), et ceux de G. rainieri et E. nivalis ont été assemblés à l'Institute for Genome Sciences (University of Maryland, Baltimore, MD, USA).

Les échantillons contenant l'AFP ont été injectés dans une grille remplie d'huile d'immersion sur une unité Peltier. La température a été contrôlée à l'aide d'un osmomètre nanolitre (Micro-Ice Ltd, Alon Shvut, Israël) et d'un contrôleur de température modèle 3040 (Newport, Irvine, CA, USA). Les échantillons ont été congelés rapidement et ont fondu lentement jusqu'à ce qu'il ne reste qu'un seul cristal de glace. La température a été maintenue juste en dessous du point de fusion, puis a diminué à une vitesse de 0,075 °C/min jusqu'à ce que la formation de glace commence. Des vidéos des cristaux de glace lors des mesures TH ont été enregistrées soit à l'aide d'une caméra CCTV Panasonic WV-BL200, soit d'une caméra industrielle monochrome DMK 33UX249 USB 3.0 (The Imaging Source, Charlotte, Caroline du Nord, États-Unis).

Des gènes synthétiques optimisés en codons pour les AFP de G. rainieri (QQY00623.1) et Folsomia candida (OXA44825.1) ont été commandés auprès de GeneArt (Thermo Fisher, Waltham, MA, États-Unis). L'ADN codant pour le peptide signal a été retiré et un résidu méthionine N-terminal a été codé pour aider à introduire un site de coupure Ndel. A l'extrémité C-terminale, des codons de leucine et de glutamate ont été introduits pour ajouter un site de coupure Xhol. Les gènes ont été sous-clonés dans des vecteurs pET-24a39. Les plasmides résultants ont été transformés dans des cellules compétentes TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) pour isolement à l'aide d'un kit GeneJET Plasmid Miniprep (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA). Les séquences d'ADN ont été vérifiées avant que les plasmides ne soient retransformés dans des cellules d'expression BL21 (DE3) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Les cultures cellulaires ont été cultivées dans un bouillon de lysogénie avec 100 µg/mL de kanamycine à 37 °C. Après avoir atteint une DO600 de 0, 6 à 0, 8, les cultures cellulaires ont été refroidies à 20 ° C et 1 mM d'isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside a été ajouté pour induire la culture cellulaire pendant la nuit. Les cellules ont été centrifugées à 4500 × g pendant 30 min et remises en suspension dans 50 mL de tampon de lyse (Tris/HCl 20 mM (pH 7,8), NaCl 500 mM, imidazole 5 mM, fluorure de phénylméthylsulfonyle 0,1 mM et un comprimé dissous de cocktail inhibiteur d'ultra protéase cOmplete™). Les cellules ont été soniquées 16 fois à 10 s par cycle et refroidies à 4 ° C entre les cycles pour éviter la dénaturation des protéines.

Les AFP recombinantes marquées par His ont été séparées du surnageant de lysat en utilisant une chromatographie d'affinité Ni. Les fractions contenant l'AFP ont été regroupées, chargées dans un ballon à fond rond de 250 ml ensemencé avec une coquille de glace et purifiées par affinité avec la glace39.

Les identifiants de taxonomie pour chaque espèce ont été extraits de la base de données de taxonomie du NCBI. L'arbre phylogénétique a été assemblé à l'aide de phyloT (https://phylot.biobyte.de/).

Les surnageants d'homogénat entier de 22 espèces différentes de collemboles ont été évalués pour l'activité TH et la formation de cristaux de glace (Fig. 1). Sur les 22 espèces testées, 18 avaient une activité TH. Les cristaux de glace uniques surveillés dans les homogénats actifs ont fondu en formes oblongues définies qui étaient symétriques autour de l'axe c, ce qui suggère que les AFP se lient et stabilisent plusieurs plans de glace, y compris le plan basal. En revanche, les cristaux formés en présence d'un AFP qui ne se lie pas au plan basal, à savoir l'AFP de type I, fondent en disques qui se transforment en bipyramides hexagonales au fur et à mesure de leur refroidissement (Fig. 1, panneaux en haut à gauche). Lorsque le point de congélation était dépassé dans les échantillons de collemboles, la croissance de la glace dendritique émanait des axes a et augmentait rapidement dans les échantillons qui avaient une activité TH élevée. Chez Hypogastrura viatica et M. arctica, l'éclatement dendritique couvrait le champ de vision en une image (1/12 s). En revanche, les cristaux de glace dans le témoin tampon étaient en forme de disque et continuaient à croître avec la même forme, tandis que l'éclatement avec l'AFP de type I s'est produit le long de l'axe c (Fig. 1 panneaux en haut à droite). Les échantillons ont été homogénéisés aux mêmes rapports poids/volume, ce qui a permis de comparer l'activité TH relative, et l'activité chez différentes espèces variait de 0,2 à 1,7 °C. Ces différences pourraient provenir de la variation du nombre de copies de gène, des niveaux d'expression et/ou de l'activité des AFP.

Comparaison de la mise en forme de la glace dans les homogénats de collemboles. Les collemboles lyophilisés ont été doucement homogénéisés dans un tampon (8: 1 v / w) et les surnageants ont été dosés pour l'activité antigel (TH). Pour chaque espèce (colonne de gauche), une image a été capturée à partir de la vidéo lors de la mesure TH (colonne du milieu) et juste au moment où le point de congélation a été dépassé (colonne de droite). Le témoin positif est l'AFP de type I de la plie rouge (Pseudopleuronectes americanus). Le contrôle négatif est un tampon (Tris-HCl 50 mM (pH 7,8), NaCl 150 mM, phénylthiocarbamide 1 mM et 1 × cocktail d'inhibiteurs de protéase Roche sans EDTA).

L'analyse du plan de glace fluorescent de la grande isoforme AFP de H. harveyi a montré une liaison aux plans de base et de prisme de la glace38. La prise en charge de la liaison au plan basal a également été fournie par la structure cristalline aux rayons X de GrAFP, car les eaux cristallographiques pouvaient être alignées à la fois sur les plans de prisme basal et primaire de la glace39. De plus, l'activité élevée (> 2 °C) de deux des homogénats suggère que, comme chez d'autres arthropodes tels que Tenebrio molitor41, la plupart des collemboles produisent des AFP hyperactives. De plus, les différences constantes dans la formation de la glace et l'éclatement entre les AFP de collemboles et les AFP de type I de la plie rouge (figure 1) sont probablement dues à la liaison au plan basal par les AFP de collemboles.

Les compositions en acides aminés des AFP extraites de trois espèces de collemboles (H. harveyi, G. rainieri et M. arctica) ont déjà été rapportées29,31,39. Ici, des extraits d'AFP de trois espèces supplémentaires (Cryptopygus antarcticus, Folsomia candida et Protaphorura pseudovanderdrifti) ont également été soumis à une analyse des acides aminés (tableau supplémentaire 2). Tous avaient des abondances élevées de glycine et d'alanine, qui sont le diagnostic du pli du faisceau hélicoïdal PPII. Cependant, ces proportions de glycine et d'alanine étaient inférieures à celles de H. harveyi, qui avait été davantage purifiée, suggérant une certaine contamination par des traces d'autres protéines. Il faut s'y attendre car chaque cycle d'IAP ne réduit que les niveaux de protéines non-AFP d'environ 10 fois40. Néanmoins, MALDI-MS a suggéré que les AFP étaient l'espèce dominante après l'IAP (Fig. 2). Les extraits de P. pseudovanderdrifti (Fig. 2A), C. antarcticus (Fig. 2B) et Ceratophysella denticulata (Fig. 2C) ont tous montré quelques pics discrets, correspondant à deux ou plusieurs petites isoformes (5,9–8,8 kDa) et une ou plusieurs grandes isoformes (15,5–17,5 kDa), similaires à ce qui avait été précédemment rapporté pour M. arctica (Fig. 2D)31 et H. harveyi (6,5 et 15,7 kDa)29. En revanche, F. candida a un pic principal composé de quatre sous-pics qui diffèrent d'environ 16 Da (Fig. 2E) et G. rainieri (Fig. 2F)39 a trois groupes d'isoformes dans une plage plus étroite de 6,9 ​​à 12,2 kDa. Il semble également y avoir de petites variations dans les isoformes comme indiqué par les pics d'épaule. Tout comme les cinq isoformes de 9,6 kDa de G. rainieri39, il existe probablement des isoformes au sein de chaque population avec quelques polymorphismes d'acides aminés.

Spectres MALDI d'extraits purifiés de collembolan AFP. Les protéines de : (A) Protaphorura pseudovanderdrifti, (B) Cryptopygus antarcticus, (C) Ceratophysella denticulata, (D) Megaphorura arctica, (E) Folsomia candida et (F) Granisotoma rainieri ont été purifiées avec quatre cycles de purification par affinité avec la glace et soumises à MALDI-MS. Les masses maximales majeures sont étiquetées.

Le séquençage partiel des AFP purifiées par spectrométrie de masse en tandem de fragments tryptiques fournit un lien robuste entre les protéines isolées et leurs séquences d'acides nucléiques. Cela a déjà aidé à déduire les séquences AFP pleine longueur de M. arctica et G. rainieri à partir des données du transcriptome31,39. Dans cette étude, les fragments trypsiques des AFP de C. antarcticus et de F. candida étaient également riches en glycine et en alanine et contenaient des motifs répétés GXX (tableau 1).

Il y a plus de 3400 EST de C. antarcticus, provenant de deux études42,43, dans la base de données NCBI. Les recherches BLAST en ont identifié deux avec des séquences codantes complètes (GR869204.1 et FF279148.1) et deux avec des séquences codantes incomplètes (GR870234.1 et FF278983.1). Les transcrits de pleine longueur codaient pour une protéine de 108 acides aminés (8, 5 kDa) après l'élimination du peptide signal de 19 acides aminés (figure 3A). GR870234.1 manquait le codon d'initiation N-terminal de la méthionine et FF278983.1 avait une extrémité C tronquée au résidu 86. Des pics avec des masses similaires ont été observés dans le profil MALDI (Fig. 2B). Des isoformes supplémentaires ont été identifiées dans le transcriptome généré dans cette étude ; trois qui codent les isoformes de 8,5 kDa (OQ445583, OQ445586 et OQ445587) et huit qui codent les isoformes de 15 kDa (OQ445584, OQ445585, OQ445588, OQ445589, OQ445590, OQ445591, OQ4455 92, OQ445593). Les isoformes de 8,5 kDa avaient entre 91 et 93 % d'identité de séquence aux niveaux des nucléotides et des protéines (Fig. 3A). En utilisant un schéma pour visualiser chaque hélice, les isoformes de 8,5 kDa peuvent être modélisées pour avoir 6 hélices (Fig. 3B). Les chaînes de 3 à 4 motifs répétés GX1X2 peuvent être séparées en hélices individuelles séparées par des régions de boucle variables d'une longueur de 3 à 6 résidus d'acides aminés. Les résidus X2 dans une hélice et l'hélice suivante alternent entre un résidu hydrophobe et hydrophile, ce qui produit le site distinctif de liaison à la glace (Fig. 3 surfaces bleues) et le site sans liaison à la glace (Fig. 3 surfaces rouges). Les isoformes de 15 kDa se sont regroupées en trois groupes. Le premier groupe avait trois isoformes avec un peptide signal de 20 acides aminés et une protéine mature de 192 acides aminés (Fig. 4A). CaAFPb-4 avait une délétion de quatre acides aminés, faisant de la protéine mature une longueur de 188 acides aminés. Le deuxième groupe avait trois isoformes avec un peptide signal de 19 acides aminés et une protéine mature de 192 acides aminés (Fig. 4B). Le troisième type avait une seule isoforme (CaAFPb-8) avec un peptide signal de 19 acides aminés et une protéine mature de 187 acides aminés (Fig. 4C). Dans les premier et deuxième groupes, les isoformes ont montré entre 88–99% et 98–99% d'identité de séquence, respectivement, tandis qu'entre ces groupes et le troisième type d'isoforme, il n'y avait que 50–52% d'identité de séquence. Au sein de chaque groupe, les séquences d'acides aminés dans la boucle et les régions non-IBS étaient moins conservées entre les isoformes. Lorsque les trois groupes de CaAFP de 15 kDa sont comparés, le nombre d'hélices PPII était constant, avec 11 prédits (Fig. 4), et la longueur de chaque hélice était à peu près équivalente, avec trois à quatre répétitions GXX ou GGX chacune. De plus, le nombre de liaisons disulfure prédites variait de 2 à 4. Les masses moyennes prédites de CaAFPb-8 (15, 2 kDa) et de CaAFPb-6 (15, 5 kDa) correspondent étroitement aux pics de 15 158 et 15 463 Da vus par MALDI (Fig. 2B).

Alignement de séquence des isoformes de CaAFP de 8,5 kDa. (A) Les séquences d'acides aminés des isoformes de CaAFP des EST et le transcriptome généré ont été alignés. Les résidus d'acides aminés identiques sont surlignés en gris. Les résidus de glycine sont colorés en bleu. Les résidus de cystéine sont colorés en rouge et surlignés en jaune. Les peptides signal sont représentés en minuscules et la séquence codante est représentée en majuscules. Les rectangles ci-dessous montrent des hélices PPII putatives pour les faces IBS (bleu) et non IBS (rouge). CaAFPa-1, OQ445586; CaAFPa-2, GR870234; CaAFPa-3, OQ445587; CaAFPa-4, FF279148; CaAFPa-5, OQ445583; CaAFPa-6, GR869204; CaAFPa-7, FF278983. (B) Schéma de six faisceaux hélicoïdaux polyproline de type II. Les hélices antiparallèles sont reliées par des régions en boucle (non représentées) et disposées en deux couches. La surface de liaison à la glace (bleu) et la surface non liée à la glace (rouge) sont affichées. La liaison hydrogène entre les hélices stabilise le pli.

Alignement de séquence des isoformes de CaAFP de 15 kDa. Les séquences d'acides aminés des isoformes de CaAFP du transcriptome généré ont été alignées pour les premier et deuxième groupes (A). (C) La troisième isoforme de CaAFP (CaAFPb-8) est alignée sur une séquence du premier groupe (CaAFPb-3) et du deuxième groupe (CaAFPb-6). La coloration est la même que sur la Fig. 3. CaAFPb-1, OQ445590 ; CaAFPb-2, OQ445584; CaAFPb-3, OQ445585; CaAFPb-4, OQ445589; CaAFPb-5, OQ445588; CaAFPb-6, OQ445592; CaAFPb-7, OQ445593; CaAFPb-8, OQ445591.

L'assemblage annoté du génome de F. candida44 s'est avéré contenir un seul gène codant pour une séquence riche en glycine (OXA44825.1), ici appelée FcAFP, ressemblant à d'autres AFP hélicoïdales PPII. FcAFP partage 57 % d'identité de séquence avec GrAFP-4 (Fig. 5A). Il a été prédit que FcAFP avait une structure très similaire à celle de GrAFP-4 résolue par cristallographie39, avec neuf hélices PPII formant une face de liaison à la glace composée des quatre hélices paires.

Schémas du faisceau hélicoïdal en polyproline de type II. Les séquences protéiques de FcAFP et CcAFP disposées en hélices de polyproline individuelles. (A) FcAFP peut être organisé en 9 hélices et (B) CcAFP peut être organisé en 12 hélices. La coloration est la même que sur la Fig. 3.

Les fragments trypsiques analysés par spectrométrie de masse en tandem (tableau 1) soutiennent l'affirmation selon laquelle F. candida, contrairement aux autres espèces examinées, n'a qu'une seule isoforme de l'AFP. Les spectres dominants correspondaient aux trois fragments tryptiques prédits, et ils ont été séquencés plusieurs fois, sur la majeure partie de leur longueur. Comme le génome44 et cet échantillon (tableau supplémentaire 1) provenaient de la même souche de laboratoire parthénogénétique, cette correspondance exacte n'était pas inattendue. Des fragments similaires de masses différentes sont nés soit de la fragmentation interne du fragment trypsique45, soit via une modification post-traductionnelle. Les fragments étaient parfois 16 Da plus lourds que prévu, la masse supplémentaire coïncidant avec les résidus de proline qui étaient suivis des résidus de glycine (tableau 1, en gras).

La séquence du gène et les séquences des fragments trypsiques étaient compatibles avec les masses observées par MALDI-MS. Le pic dominant était à 9646 m/z, avec les espèces à double charge à 4832 m/z, mais un examen attentif du spectre (Fig. 2E, en médaillon) révèle quatre pics différant d'environ 16 Da. Le plus léger, à 9632 m/z, correspond étroitement à la masse moyenne de 9630 Da prédite pour la protéine mature sans modifications, tandis que les autres à 9464, 9663 et 9679 contiennent probablement 1, 2 ou 3 proline modifiée, respectivement. Une augmentation de masse de 16 Da est compatible avec l'hydroxylation de la proline. Le collagène contient des répétitions X1-X2-G et la structure se compose de trois hélices PPII en parallèle qui forment la triple hélice de collagène46. La proline est modifiée en hydroxyproline dans les motifs XPG partout47. Par conséquent, il est probable que le même processus soit responsable de la modification, en moyenne, d'un des six motifs XPG de l'AFP, étant donné que les séquences répétées et la structure secondaire des deux protéines sont similaires.

La protéine extraite de F. candida n'avait que 0, 2 ° C d'activité TH à la concentration testée, inférieure à la plupart des autres espèces (Fig. 1). Lorsqu'il est exprimé de manière recombinante dans E. coli, le FcAFP atteint 0,52 ± 0,01 °C de TH à une concentration de seulement 2,3 μM. Ceci suggère que même après acclimatation au froid, les niveaux d'AFP produits chez l'animal à partir de ce seul gène sont bien inférieurs à ce qui peut être atteint in vitro. Malgré la production d'une PAG, lorsque F. candida a été exposé à − 3 °C pendant 15 jours, aucun spécimen n'a survécu32. Cependant, lorsqu'ils sont privés de nourriture, leur point de surfusion est inférieur à -15 °C48. Les arthropodes ayant une activité TH élevée ont généralement plus d'un gène AFP, produisant différentes isoformes d'AFP, comme en témoignent la tordeuse des bourgeons de l'épinette avec ses 16 copies de gène49, et les autres collemboles ici.

Entomobrya nivalis était auparavant connu pour avoir jusqu'à 3,5 °C d'activité TH dans son hémolymphe pendant les mois d'hiver50. Par conséquent, le nombre limité d'animaux qui ont été collectés sur le terrain ont été acclimatés, avant que leur ARN ne soit extrait. Un transcriptome a été généré à partir duquel cinq isoformes d'AFP ont été identifiées (Fig. 1B supplémentaire). Chaque séquence avait un peptide signal entre 22 et 24 acides aminés de longueur. Les protéines matures avaient des masses prédites de 8,9 kDa, 9,6 kDa et 11,2 kDa. L'isoforme de 8,9 kDa (EnAFP-2) était identique à 86 % à l'isoforme de 11,2 kDa (EnAFP-3) avec une délétion de 29 acides aminés qui supprime probablement deux hélices. Les autres séquences avaient entre 64 et 81 % d'identité.

En utilisant les séquences d'autres AFP de collemboles comme requête BLAST, une séquence ressemblant à une AFP hélicoïdale PPII a été trouvée dans le génome de Ceratophysella communis (VNWX01004235.1). La protéine mature avait une longueur de 220 acides aminés et peut être modélisée pour avoir 12 hélices PPII (Fig. 5B). Bien que C. communis n'ait pas été collecté, C. denticulata l'était et l'homogénat contenait 0, 7 ° C de TH (Fig. 1). De plus, le plus grand pic sur le MALDI-MS avait une masse de 17,5 kDa, similaire aux 17,2 kDa prédits pour la séquence AFP mature de C. communis.

Dix des espèces de collemboles échantillonnées provenaient de Poduromorpha et 12 provenaient d'Entomobryomorpha (Fig. 6). Les dix poduromorphes et les huit entomobryomorphes avaient une activité AFP. Les quatre espèces dépourvues d'activité AFP appartenaient à la famille des Entomobryidae, mais E. nivalis faisait également partie de cette famille et avait une activité AFP. Quatorze autres espèces ont été testées pour l'activité TH par d'autres28,30,53, pour un total de 11 poduromorphes sur 11 et 15 entomobryomorphes sur 25 testés positifs pour l'activité AFP. Parmi les espèces qui ne produisaient pas d'AFP, deux ont de nouveau été trouvées chez les Entomobryidae, ainsi que quatre chez les Isotomidae.

Arbre taxonomique des collemboles producteurs de protéines antigel. Un arbre taxonomique pour les espèces des quatre ordres de Collembola (Entomobryomorpha, Poduromorpha, Symphypleona et Neelipleona) a été généré sur la base de la taxonomie NCBI. Les espèces avec et sans activité TH sont colorées en rouge et bleu, respectivement, et les groupes non testés sont en noir. Les espèces testées dans cet article sont en gras et toutes les autres espèces non en gras ont été testées par Zettel28, à l'exception de Gomphiocephalus hodgsoni30 et Cryptopygus terranovus (syn. Gressittacantha terranova)53. Les espèces avec une étoile produisaient des PAG riches en glycine. Gomphiocephalus hodgsoni avec un carré rouge est une AFP proposée riche en cystine et en histidine30.

On a prédit que le faisceau hélicoïdal PPII riche en glycine était le pli AFP de huit espèces de collemboles, couvrant cinq familles et deux ordres. La présence d'AFP hélicoïdales PPII chez Entomobryomorpha et Poduromorpha suggère que cette famille de protéines est née avant leur divergence (Fig. 7). La séquence exacte de la diversification taxonomique des collemboles fait encore l'objet de débats. Les quatre ordres peuvent être organisés en clades sœurs assorties en fonction des ensembles de données utilisés. Lors de l'utilisation des séquences 18S et 28S, Neelipleona était basale à (Symphypleona + (Entomobryomorpha + Poduromorpha) 54. Pourtant, lors de l'utilisation des séquences 16S, 28S et cox1, les positions de Neelipleona et Symphypleona étaient inversées et Symphypleona était basale 55. Indépendamment de la relation phylogénétique exacte, la datation mitochondriale suggère que les quatre ordres ont divergé entre 437 et 421 millions d'années 56. Cette période coïncide avec la glaciation andine-saharienne, une période glaciaire qui a duré de 460 à 420 millions d'années 57. De plus, les lignées correspondant aux familles existantes ont divergé entre 414 et 184 millions d'années 56, au cours de laquelle la glaciation du Karoo s'est produite, il y a entre 360 ​​et 255 millions d'années 58. La diversification et le besoin de résistance au gel dans le même laps de temps permettraient la radiation de la espèces exprimant l'AFP hélicoïdale PPII.

La relation entre la phylogénie des collemboles et les périodes glaciaires. Un arbre phylogénétique montrant la chronologie de la divergence chez Collembola. Les ombrés vert, violet et jaune indiquent les temps estimés de divergence des ordres, des familles et des genres/espèces, respectivement. Le nombre d'espèces productrices d'AFP est indiqué sous le nom de la commande. La flèche rouge indique l'émergence des PAG de poissons au cours de l'ère cénozoïque. Les icebergs affichent la durée de chaque période glaciaire respective.

Le moment de la diversification en genres aurait pu conduire à des espèces dépourvues d'AFP. Au sein de la superfamille Entomobryoidea, Sinella curviseta, Heteromurus nitidus, Lepidocyrtus violaceus et trois espèces du genre Orchesella n'ont pas montré d'activité antigel des PAG, contrairement à E. nivalis (Fig. 6). Les analyses d'un échantillon de collemboles de Chine ont estimé que cinq clades polyphylétiques du genre Entomobrya se sont diversifiés il y a entre 66 et 34 millions d'années lors du maximum thermique Paléocène-Éocène59. Au cours de cette période, il y a environ 55 millions d'années, les températures mondiales étaient en moyenne de 5 à 8 °C supérieures à celles d'aujourd'hui60. On estime que Sinella a divergé d'un clade d'Entomobrya il y a environ 69 millions d'années, tandis que Heteromurus et Orchesella ont divergé de la famille des Entomobryidae il y a environ 100 millions d'années59. L'ancêtre des espèces dépourvues d'AFP dans la superfamille Entomobryoidea pourrait avoir perdu son AFP pendant cette période, conduisant à la radiation d'espèces sans gène AFP, tandis que la lignée E. nivalis a conservé la leur.

Contrairement aux poissons téléostéens, où les AFP ne sont apparus qu'à l'ère cénozoïque (il y a environ 30 millions d'années) après le maximum thermique du Paléocène-Éocène20, il n'y a aucun signe de diversification soudaine des AFP collemboles lors de cet événement ou de la précédente glaciation du Karoo. En théorie, certaines lignées peuvent avoir perdu leur(s) gène(s) de type PPII AFP au cours d'une période interglaciaire, pour ensuite évoluer vers un remplaçant pour faire face à une nouvelle ère glaciaire. Pour cette raison, il convient de noter la composition différente en acides aminés d'un PAG précédemment identifié chez l'espèce de collembole antarctique, Gomphiocephalus hodgsoni30. Cet AFP contenait des pourcentages élevés d'histidine et de cystine qui le distinguaient des AFP de type PPII (tableau supplémentaire 2). Cependant, la séquence de cette PFA n'a pas encore été identifiée. Fait intéressant, cette espèce fait partie de la famille des Hypogastruridae dans laquelle deux espèces (H. harveyi et C. communis) produisent des AFP hélicoïdales PPII riches en glycine.

Les origines et la parenté des AFP PPII sont difficiles à déterminer car la nature répétitive de la protéine rend les comparaisons entre des espèces éloignées extrêmement difficiles. L'homologie ne peut pas être facilement déduite à partir de séquences répétitives, en particulier lorsqu'elles sont en cours de sélection pour une activité antigel. Par exemple, les AFP de type I riches en alanine des poissons, dont certains ont des résidus de thréonine à des intervalles de 11 acides aminés, semblaient initialement homologues, mais on sait maintenant qu'ils ont évolué par convergence au cours des 30 derniers millions d'années15. Heureusement, l'origine des PAG de type I du flet a été tracée via leurs UTR20. Il est possible que la convergence ait également joué un rôle dans l'évolution des PAG collemboles. Cependant, cela semble peu probable, car toutes les espèces sauf une examinées à ce jour produisent des AFP riches en glycine et les séquences connues forment34,39, ou peuvent être modélisées (Figs. 3, 5)31,38 comme des faisceaux hélicoïdaux PPII avec une face de liaison à la glace. En revanche, lorsque les AFP sont apparues chez les poissons et les insectes téléostéens, une variété de replis protéiques différents ont été utilisés comme AFP61, 62, 63, 64, 65. De plus, la longueur des hélices PPII ne varie pas entre les isoformes ou les espèces. Lorsqu'une répétition GGX supplémentaire a été ajoutée à chaque hélice de GrAFP, l'activité TH a diminué, suggérant qu'il pourrait s'agir d'une pression sélective pour limiter la longueur des hélices37.

Il est peu probable qu'une analyse des UTR des PAG collemboles fournisse des indices sur leurs origines. De nombreuses espèces étudiées ici ont divergé beaucoup plus tôt que les poissons téléostéens (Fig. 7). Cela a donné suffisamment de temps à leurs régions non codantes pour diverger à un point tel qu'elles ne peuvent plus être reconnues comme homologues. Cela est évident même lorsque les 5ʹ- et 3ʹ-UTR sont comparés entre les transcrits d'une même espèce. Par exemple, les 5ʹ- et 3ʹ-UTR des EnAFP ont respectivement entre 65 et 93 % et 60 et 84 % d'identité de séquence. L'absence d'identité de séquence non codante a déjà été rapportée entre HhAFP et MaAFP31, et entre les isoformes de HhAFP38 et GrAFP39. Cela suggère que certains de ces PAG PPII, même ceux de la même espèce, divergent depuis bien plus de 30 millions d'années.

L'une des limites de cette étude était notre incapacité à échantillonner des espèces de Neelipleona ou de Symphypleona. Il existe actuellement une sous-représentation des données génomiques et transcriptomiques pour ces ordres par rapport à Entomobryomorpha et Poduromorpha, mais neuf séquences génomiques sont accessibles au public au NCBI. Bien que les AFP PPII n'aient pas été trouvés dans les huit séquences génomiques de Symphypleona et une de Neelipleona, il convient de noter que la nature répétitive des AFP PPII, ainsi que l'abondance de gènes riches en glycine (tels que le collagène), les introns et les séquences répétitives remplies de codons potentiels de glycine, rendent difficile l'identification des gènes AFP. Par conséquent, l'identification de ces AFP dépend fortement de l'extraction des tissus. Malheureusement, à notre connaissance, la culture en laboratoire de Symphypleona et Neelipleona est difficile, ce qui complique les études détaillées sur les PAG dans ces deux ordres.

Les ensembles de données générés au cours de l'étude actuelle sont disponibles dans le référentiel GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) sous les numéros d'accession OQ511494-98 et OQ445583-93.

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Nous remercions David McLeod de l'installation de découverte de la fonction des protéines de l'Université Queen's pour l'analyse MALDI des AFP. Nous sommes reconnaissants à Marie Boddington pour l'analyse préliminaire des PAG de Megaphorura arctica et de Folsomia candida, à David Denlinger pour la collection de Cryptopygus antarcticus et à Matty Berg pour la collection d'Isotoma riparia. Ce travail a été soutenu par la Fondation des IRSC Grant FRN 148422 à PLD et Det Frie Forskningsråd Grant 1026-00055B à MH. PLD est titulaire de la Chaire de recherche du Canada en génie des protéines. Les bailleurs de fonds n'ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte/l'analyse/l'interprétation des données, la rédaction du rapport ou la soumission de l'article pour publication.

Département des sciences biomédicales et moléculaires, Université Queen's, 18, rue Stuart, Kingston, ON, K7L3N6, Canada

Connor L. Scholl, Laurie A. Graham et Peter L. Davies

Section d'écologie terrestre, Département d'écoscience, Université d'Aarhus, CF Møllers Allé 4, 8000, Aarhus C, Danemark

Martin Holmstrup

Arctic Research Center, Université d'Aarhus, Ny Munkegade 114, 8000, Aarhus C, Danemark

Martin Holmstrup

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Conceptualisation, PLD, MH et LAG ; méthodologie, tous auteurs; enquête, CLS et GAL ; ressources, PLD et MH ; rédaction—original, CLS, PLD et LAG ; rédaction—révision et édition, tous les auteurs; visualisation, CLS ; acquisition de financement, PLD et MH

Correspondance à Peter L. Davies.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Scholl, CL, Holmstrup, M., Graham, LA et al. Les protéines antigel hélicoïdales polyproline de type II sont répandues dans les collemboles et sont probablement apparues il y a plus de 400 millions d'années à l'époque ordovicienne. Sci Rep 13, 8880 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35983-y

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Reçu : 31 mars 2023

Accepté : 26 mai 2023

Publié: 01 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-35983-y

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